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ProteanFect Max (PT02) 轉(zhuǎn)染人源CD34+造血干細(xì)胞操作攻略
CD34+造血干細(xì)胞的分選
對(duì)于人源CD34+造血干細(xì)胞，合適的培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)染非常關(guān)鍵。CD34+造血干細(xì)胞分選后需要培養(yǎng)一段時(shí)間恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)后，以實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染效率。以來(lái)自動(dòng)員人單采血或臍帶血開(kāi)始，可以使用市面上陽(yáng)性選擇分選試劑盒分離得到CD34+細(xì)胞群。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為動(dòng)員人單采血，分離試劑為L(zhǎng)ymphoprep™（Stemcell，07861），分選試劑盒為CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）。具體實(shí)驗(yàn)操作參考其官·方說(shuō)明書(shū)。
注：在紅細(xì)胞數(shù)量較多的情況下，應(yīng)先分離PBMC，再使用試劑盒進(jìn)行分選。具體操作應(yīng)根據(jù)所選材料和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞分選。
CD34+造血干細(xì)胞完·全培養(yǎng)基的配制
SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell，09655）和StemSpan™ CC100（Stemcell，02690）以99：1比例充分混合后使用（若添加抗生素則抗生素稀釋1000倍），配置完培養(yǎng)基放置于4℃冰箱儲(chǔ)存（盡量在1個(gè)月內(nèi)使用完）。
CD34+造血干細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
1.分選得到的CD34+造血干細(xì)胞300 g離心5 min，用1 mL完·全培養(yǎng)基重懸后，取樣計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用完·全培養(yǎng)基重懸到105 cells/mL活細(xì)胞密度，接種到T25培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
培養(yǎng)容器 | 每孔體積 | 細(xì)胞密度 |
T25 | 8.0 mL | 105 cells/mL |
6-well plate | 2.5 mL | 105 cells/mL |
24-well plate | 1.0 mL | 105 cells/mL |
48-well plate | 0.5 mL | 105 cells/mL |
2.3天后補(bǔ)液一次，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105 cells/mL，之后隔天補(bǔ)液調(diào)整密度至2×105 cells/mL ，培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度控制在1.5×106cells/mL 以內(nèi)。
注：若不及時(shí)補(bǔ)液，細(xì)胞狀態(tài)及后續(xù)擴(kuò)增受不可逆影響。
3.推薦在CD34+造血干細(xì)胞分離后培養(yǎng)5-10天進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如果細(xì)胞分離后直接轉(zhuǎn)染或細(xì)胞傳代時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后再轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力與轉(zhuǎn)染效率可能會(huì)降低或者CD34+造血干細(xì)胞比例偏低。對(duì)于使用上述動(dòng)員單采血來(lái)源的CD34+造血干細(xì)胞，最佳的轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)是在分離培養(yǎng)后的第5天。
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使用ProteanFect Max（PT02)進(jìn)行人CD34+造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染
1.轉(zhuǎn)染的核酸：mRNA
2.適合轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基（或無(wú)血清RPMI 1640/無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
3.配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系：具體詳見(jiàn)表1-3。轉(zhuǎn)染體系在配置過(guò)程中出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象屬于正常。
4.轉(zhuǎn)染前細(xì)胞準(zhǔn)備：確保細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，活率需超過(guò)90%。調(diào)整細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度時(shí)，避免反復(fù)離心，以免延長(zhǎng)處理時(shí)間，影響細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)染效率。
5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：孵育時(shí)間建議保持在15分鐘，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間可提高轉(zhuǎn)染率，但可能影響細(xì)胞活力。
6.轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活率檢測(cè)：使用陽(yáng)性對(duì)照mRNA時(shí)，可在轉(zhuǎn)染后5-48小時(shí)內(nèi)觀察EGFP的表達(dá)。細(xì)胞活率可通過(guò)鏡下觀察、臺(tái)盼藍(lán)、AO/PI染色或流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)，若細(xì)胞狀態(tài)良好，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞圓潤(rùn)透亮。
表1. ProteanFectMax轉(zhuǎn)染人源CD34+造血干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟說(shuō)明
（以96孔板轉(zhuǎn)染mRNA為例）
操作步驟 | 人源CD34+造血干細(xì)胞 |
1 配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系 | |
1.1 將Reagent A與mRNA混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混勻（Reagent A使用前需顛倒混勻） |
1.2 加入Reagent B輕柔充分混勻 | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B混勻一分鐘（動(dòng)作輕柔避免產(chǎn)生氣泡） |
1.3 加入Reagent C混勻 | 往上述混合物中加入8-13.5 μL Reagent C混勻（動(dòng)作輕柔避免產(chǎn)生氣泡）a |
2 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞處理 | |
2.1人源CD34+造血干細(xì)胞準(zhǔn)備（洗滌盡量去除培養(yǎng)基，以免影響轉(zhuǎn)染效果） | 取1×105 CD34+造血干細(xì)胞，加入Opti-MEM，300 g離心5分鐘，去上清，收集細(xì)胞沉淀，加入Opti-MEM重懸再洗滌一次，用20 μL Opti-MEM重懸細(xì)胞調(diào)至1×10? cells/mL備用 |
3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 | |
3.1混合轉(zhuǎn)染體系與細(xì)胞 | 將上述ProteanFect轉(zhuǎn)染液與20 µL細(xì)胞懸液混合均勻（動(dòng)作輕柔避免產(chǎn)生氣泡） |
3.2 孵育 | 37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘 |
3.3 終止反應(yīng)與洗滌 | 加入至少200 µL完·全培養(yǎng)基，300 g離心5分鐘，棄上清（殘留約20μL液體） |
3.4 細(xì)胞培養(yǎng)與觀察 | 加入適量完·全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，后續(xù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè) |
a. 由于人源CD34+造血干細(xì)胞的個(gè)體差異較大建議先加入13.5 μL的Reagent C。如果細(xì)胞活率不佳，可將Reagent C的使用量下調(diào)至8 μL。
表2. ProteanFect Max轉(zhuǎn)染不同類(lèi)型核酸的實(shí)驗(yàn)操作步驟說(shuō)明（以96孔板轉(zhuǎn)染為例）
操作步驟 | 人源CD34+造血干細(xì)胞 | |
1 配置ProteanFect轉(zhuǎn)染體系 | mRNAa | siRNAb |
1.1 將Reagent A與核酸混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混勻 | 在40 µL Reagent A中加入40 pmol siRNA，充分混勻 |
1.2 加入Reagent B | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B | 往上述混合物中加入1.4 μL Reagent B |
1.3 加入Reagent C | 往上述混合物中加入8 μL Reagent C | 往上述混合物中加入13.5 μL Reagent C |
2轉(zhuǎn)染前細(xì)胞處理 | 詳見(jiàn)表2 | |
3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 | 詳見(jiàn)表2 | |
a. 建議mRNA濃度≥1 μg/mL。如需同時(shí)轉(zhuǎn)染多個(gè)mRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個(gè)mRNA時(shí)保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的mRNA總量為0.5 µg。
b. 建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時(shí)轉(zhuǎn)染多個(gè)siRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個(gè)siRNA時(shí)保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的siRNA總量為40 pmol。
表3. ProteanFect Max轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞培養(yǎng)孔板規(guī)格的各組分使用量
a. 由于CD34+造血干細(xì)胞存在較大個(gè)體差異，建議對(duì)Reagent C進(jìn)行多個(gè)梯度測(cè)試，以綜合考慮細(xì)胞活率和轉(zhuǎn)染效率，從而選擇最佳方案。Reagent C的使用量可低下調(diào)至初始量的50%。
細(xì)胞活率和表達(dá)效率分析
在轉(zhuǎn)染 EGFP mRNA后，可通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD34+造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力與轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行分析。首先通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的EGFP蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)和活力進(jìn)行定性評(píng)估（圖 1）。同時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞密度，流式染色PE anti-human CD34 Antibody（Biolegend ,343506）以定量分析CD34+造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞收集完成后，離心棄去培養(yǎng)基，用1 × DPBS重懸細(xì)胞，加入PE anti-human CD34 Antibody，4℃避光染色15分鐘后洗滌去上清，用1 × DPBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測(cè)（圖2）。
圖1. 利用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細(xì)胞中的表達(dá)。熒光圖（左）和明場(chǎng)圖（右）顯示，ProteanFect Max轉(zhuǎn)染人源CD34+造血干細(xì)胞中1天后。絕大部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說(shuō)明ProteanFect Max在人源CD34+造血干細(xì)胞中中具有較高的轉(zhuǎn)染效率。
圖2. 利用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細(xì)胞中表達(dá)的流式分析圖。使用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染EGFP mRNA，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)檢測(cè)到約有61.9%細(xì)胞表達(dá)EGFP蛋白。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 如何提升轉(zhuǎn)染效率
1）延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間：根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間，通常不超過(guò)30分鐘。
2. 關(guān)于試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照的使用建議
首·次嘗試時(shí)，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（EGFP mRNA），以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作和試劑的有效性。使用96孔板的細(xì)胞量即可，節(jié)省細(xì)胞和試劑。
2. 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)范圍
說(shuō)明書(shū)中提供了最佳轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)量范圍，但在特殊情況下，即使細(xì)胞數(shù)量較少，也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以96孔板為例，建議細(xì)胞數(shù)量不低于2×105/孔，以確保后續(xù)檢測(cè)的可靠性。
3. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)與活力
轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染3天后，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)基本恢復(fù)。
4. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞離心后看不到沉淀
對(duì)于小體積轉(zhuǎn)染體系（如96孔板），離心后細(xì)胞沉淀不明顯是正?，F(xiàn)象。細(xì)胞沉淀可能散落在離心管側(cè)壁，不影響后續(xù)結(jié)果。為減少細(xì)胞損失，離心后移液時(shí)應(yīng)避免槍頭緊貼底部。
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