產(chǎn)品訂購信息

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Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒產(chǎn)品歡迎您致電 華雅再生醫(yī)學旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術有限公司 

產(chǎn)品原理

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒采用多重置換擴增（MDA，Multiple Displacement Amplification）技術，對所有基因組位點進行無偏差的擴增。與基于PCR的全基因組擴增技術相比，該技術具有更好的擴增保真度，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號。

儲存條件：-20°C

質(zhì)控

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過嚴格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實驗獲得可靠的結果。

安全信息

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒時，穿戴合適的實驗防護·服，一次性手套和保護手套。詳細信息，參見SDS。

適用樣本

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒可使用各種臨床和非臨床研究樣品，包括已純化的基因組 DNA（gDNA）、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。REPLI-g Single Cell 擴增后DNA 產(chǎn)物平均長度 >10 kb，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經(jīng)開發(fā)用于新一代測序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或 qPCR 分析。

應用

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒適用于分子生物學應用。該產(chǎn)品不適用于疾病的診斷、預防或治療。推薦依據(jù)NIH發(fā)布的重組DNA實驗指南或其他指南使用所有Qiagen產(chǎn)品。

更詳細應用領域：

人 / 動物：生物標志物研究（SNP、突變、CNV），干細胞研究，循環(huán)胎兒細胞的分析（產(chǎn)前檢測篩查），嵌合研究，遺傳易感性研究，轉基因動物的分型。

癌癥：體細胞遺傳變異分析，腫瘤發(fā)展，腫瘤干細胞 / 進化，循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）的分析

細菌：宏基因組學 (Metagenomics)，研究病原體分析，微生物基因分型。

植物 * ：氣孔研究，花粉分析。

* 無細胞壁的細胞或已純化的基因組 DNA。

下游應用及儀器

全基因組測序、外顯子組測序：新一代測序平臺 ?（Illumina等）

SNP 基因分型芯片、Array CGH：芯片平臺 ?

qPCR/PCR技術：實時定量 PCR/PCR 循環(huán)儀 ?

Sanger 測序：毛細管測序儀 ?

焦磷酸測序：PyroMark®（QIAGEN）

? 多個供應商

例：全基因組測序流程

細胞樣本/基因組DNA——樣本處理——REPLI-g Single Cell Kit擴增——新一代測序

組份規(guī)格

需要用戶自備材料

微離心管

水浴或其他加熱儀器

微型離心機

漩渦混合儀（Vortexer）

吸管和吸頭

冰

操作方法選擇

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒需要根據(jù)起始樣本選擇對應操作方法

其他起始樣本：血漿血清、活檢、需要高通量擴增的樣本等參見其他對應說明書。

操作流程

方法*程

細胞樣本——加入變性混合液——65°C孵育10min——加入終止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴增DNA

方法二流程

純化基因組DNA——加入變性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴增DNA

方法一：從單細胞擴增基因組DNA

實驗開始前注意事項

1.適用樣本：1-1000個完整細胞

這個方法適用于所有物種的單細胞樣本，如：脊椎動物，細菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌），植物（細胞壁已脫），分選細胞，組織培養(yǎng)細胞和細胞。

不適用樣本：福爾馬林固定樣本或其他使用交聯(lián)劑固定的樣本，如：從福爾馬林固定石蠟包埋組織中激光顯微切割得到的單細胞樣本。

2.小心試劑不要被外源DNA污染。如：使用干凈獨立吸頭吸管，在無外源DNA地方進行反應操作。

3.純化基因組DNA擴增參見方法二。

4.聚合酶要在冰上解凍（見步驟6）。其他成分可以室溫解凍（15–25°C）。

5.配制的D2緩沖液（變性緩沖液）存放不要超過3個月。

6.陰性對照（無模板）的DNA產(chǎn)量約 40 µg。因為REPLI-g 的單細胞擴增反應中，引物二聚體的隨機擴增得到高分子量的DNA產(chǎn)物。這一DNA不會影響實際樣本質(zhì)量，也不會影響下游分析造成陽性結果。

開始前準備

試劑預處理

1.DLB緩沖液加500µl試劑盒的水混勻，稍微離心溶解。

注意：重組的DLB緩沖液–20°C能放6個月。

Buffer DLB is pH-labile.

2.所有緩沖液和試劑使用前都要用漩渦混合器充分混勻。

儀器預設

3.水浴，heating block或熱循環(huán)儀溫度設為30°C。

如果熱循環(huán)儀帶加熱蓋，蓋子溫度設為70°C。

步驟

一 變性

1.按表1配制足量（整個擴增流程所需）D2緩沖液（變性緩沖液）。

注意：表中提供的D2緩沖液用量足夠進行12次反應。沒用完的D2緩沖液–20°C 存放，但不要存放超過3個月。

表1.D2緩沖液配制

2. 4 µl樣本細胞（含PBS）加入微離心管。如果細胞不夠4 µl，加PBS sc補齊。

注意：REPLI-g單細胞擴增試劑盒提供的PBS sc量不夠用于樣本細胞的連續(xù)稀釋。

可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）

3.加入3 µl 配制的D2緩沖液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。

注意：確保樣本細胞沒有貼在緩沖液線上的管壁。

4.65°C孵育10min。

1. 加入3 µl 終止液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。冰上保存。

二 擴增

6.冰上解凍REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室溫解凍，漩渦振蕩后稍微離心。

解凍后REPLI-g sc反應緩沖液可能會形成沉淀，漩渦振蕩10s可以溶解沉淀。

7.按表2配制master混合液。混勻，稍微離心。

要點：嚴格按照表2所列順序配制。加入水和反應緩沖液后，稍微漩渦振蕩和離心后再加入DNA聚合酶。

注意：一次性進行多次反應時，根據(jù)反應數(shù)量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。

表2：master混合液配制

多次反應，根據(jù)反應數(shù)量等比例增加劑量并增加10%。

8.每次反應，10 µl 變性DNA（步驟5）加入40 µl master 混合液。

9.30°C孵育8h。

30°C孵育后，水浴或其他加熱儀可以改設為65°C方便步驟10使用。

注意：如果使用帶加熱蓋的熱循環(huán)儀，蓋子溫度設為70°C。

10.DNA聚合酶65°C滅活3min。

擴增產(chǎn)物儲存

11.如果不直接使用，擴增所得DNA 短期儲存在4°C，長期儲存在–20°C。

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒的DNA可以當作基因組DNA（zui低凍融循環(huán)），因此推薦zui低核酸儲存密度為100 ng/µl。

注意：避免多次反復凍融以確保DNA質(zhì)量。

下游應用樣本處理

12.依照說明書用水或TE適量稀釋擴增DNA。用于PCR分析的擴增DNA按1:100稀釋，每次PCR反應使用2 µl 稀釋后DNA。

13.擴增DNA可用于一系列下游應用，包括：第二代測序，array CGH和定量PCR。

注意：每50 µl典型反應的DNA產(chǎn)量約40 µg，需要正確稀釋。擴增DNA定量見附件A。

方法二：純化基因組DNA擴增

略。詳情參見原版說明書。中文版翻譯可咨詢紅榮微再。

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